3. LIBRE: sin medio soporte
ELECTROFORESIS
ZONAL: agarosa, papel,
agar, almidón,
acetato de celulosa,
poliacrilamida
4. F = E . Q E: diferencia de potencial
Q: carga
F = 6ph r v r: radio de la partícula
h: viscosidad
v = E .__Q__ v:velocidad partícula
6ph r m: movilidad
m
5. CORRIDA ELECTROFORÉTICA
• Posición definida : tamaño, forma y carga
• Dirección : carga pH (4,5-9,0) buffer
Condiciones de corrida:
Tiempo-Campo eléctrico
Geometría
MIGRACIÓN
PARTÍCULA
Medio: buffer-soporte
Relación q/m
11. Isoelectroenfoque
Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre dos
electrodos
El gradiente de estabiliza utilizando anfolitos
Las proteínas migran hasta alcanzar un pH
igual a su punto isoeléctrico
cátodo
ánodo
Es muy útil para estudiar modificaciones
postraduccionales en proteínas, trabajar
con isoenzimas, etc
12. Electroforesis en dos dimensiones
Primera dimensión: isoelectroenfoque
Segunda dimensión : SDS-PAGE
Permite analizar mezclas más complejas como extractos celulares, muestras de
sangre, etc
13. GELES DE POLIACRILAMIDA
• Muy versátiles y útiles en el análisis y
separación de mezclas de proteínas y
RNA
• Ventajas: Estables, inertes, transparentes
Muy buen efecto tamiz molecular
Tamaño de poro variable
Baja adsorción material proteico
Rápido y de bajo costo
Cantidad de muestra
24. TRABAJO PRÁCTICO
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN
CONDICIONES DESNATURALIZANTES
Objetivos específicos:
analizar los perfiles electroforéticos de las
muestras proteicas obtenidas de la purificación
de una enzima.
determinar el PM de una muestra incógnita.
Objetivo general: utilización de un método
electroforético para separar componentes según
su tamaño.
25. CONDICIONES EXPERIMENTALES
(SISTEMA MULTIFÁSICO DE BUFFERS)
Sistema discontinuo:
Gel concentrador: Tris-HCl 0,5M, pH 6,8, 4% T
Gel separador: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 10-15% T
Buffer de corrida:
Tris-glicina pH 8,3
Buffer de siembra:
Tris-HCl 0,5M, pH 6,8
Glicerol
SDS 10%
-mercaptoetanol
azul de bromofenol
SDS 0,1%
26. Tratamiento de las muestras: 20-25 mg/10 ml.
Se tratan con igual volumen de buffer de siembra y se
desnaturalizan por calor durante 5 min a 100°C.
Muestras
Selección muestras diferentes etapas del esquema de
purificación
Proteína homogénea
Patrones de PM
Proteína PM
Fosforilasa b 97400
Seroalbúmina bovina 66000
Ovoalbúmina 45000
Anhidrasa carbónica 30000
Inhibidor de tripsina 20100
-Lactalbúmina 14400
27. Detección de las bandas: fijación y tinción de las
bandas proteicas con Coomassie Blue R-250 (0,5-15 mg) y
decoloración del gel.
Solución fijadora: ácido tricloroacético 12,5 %
Reactivo para tinción: Coomassie Blue R-250 0,15%
(p/v, metanol 30%:ácido acético 10%)
Solución para desteñir: ácido acético 7%:metanol 5%
Corrida: voltaje constante
Tiempo: 30 min a 80 V
1 h a 130 V
28. MUESTRAS
A SEMBRAR : 20-25 mg/10 mL 2-2,5 mg/mL
Tratamiento con buffer de siembra dil 1:2
Llevar cada muestra a una [final] : 4-5 mg/ mL
Diluciones: en buffer Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 (50 mL)
29. TECNICA: siembra, desarrollo y revelado
1-vidrios y separadores
2-peine
3-armador para vidrios
4- soporte para geles
5-cuba de electroforesis
32. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
EN CONDICIONES NATIVAS
• Determinación de carboxilesterasas
presentes en extractos de hígado.
• Hidrolizan carboxilésteres, son de baja
especificidad y son esenciales en la
detoxificación de numerosos fármacos y
pesticidas.
33. • Actividad in vitro o en el gel: sustratos
sintéticos 1- ó 2-naftilacetato
1- ó 2-naftol sal de diazonio con Fast
Blue RR (copulación) diazo compuesto
color morado