El documento presenta los protocolos para procesamiento de muestras, infiltración e inclusión en resina, inmunomarcaje con oro y contraste para microscopía electrónica de transmisión. Describe los pasos para fijar, deshidratar, infiltrar e incluir las muestras en resina de baja temperatura para preservar la antigenuicidad. Explica cómo realizar el inmunomarcaje con oro y los pasos finales de contraste y montaje de cortes para su análisis con microscopía electrónica

1. Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Curso de Microscopía Electrónica
Presentador:
Kenneth Walker

2. Procesamiento de muestra
 Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM
clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.
 Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer
fosfato salino 0.1M por 2hrs.
 Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en
buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4
por 1hr a 0°C.
 Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%.
Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.
Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.

3. La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad
antigénica.
 Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°
 La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo
que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor
o igual a 24hrs.
 Estas resinas también pueden polimerizar químicamente a 60°C (2
a 3 días).

4. Impregnación e inclusión
The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method
For Resin
Concentration
of solvent
KM4 & HM20
30%
50%
70%
100%
Time in min
T in°C
30 min
60 min
60 min
2x60min
0
-20
-35
-50
http://www.emsdiasum.com/

5. ImmunoGold
 Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min,
diluido en TBS
 Ac primario contra la proteína buscada en TBS + NGS (2.5%
suero de cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%
 Ac secundario contra FC* conjugado con Au en TBS
 Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos
Ag-Ac.
Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son
necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.
Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

6. Contraste
Acetato de uranilo al 4% por 10 min.
y citrato de plomo de Reynolds 5 min.
Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de
plomo de Reynold 3min

7. Montaje
Los cortes siempre son sensibles al haz
de electrones. Para mejorar su
resistencia, cubrirlos con FORMVAR en
una etapa final. Esto permitirá el mejor
acceso de los anticuerpos por ambos
lados del corte.

8. Resultados hipotéticos

9. GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature
neurons 30 day after transplantation into the brain. The left picture shows a panoramic view of a mature
neuron (scale-bar= 2µm). The right picture is a higher magnification image showing morphoogical details such
as RER, mitochondria, synapsis (arrows) or nuclear pores.

10. Cromatina fina
Nucléolo
Envoltura nuclear
Aparato de Golgi
RER
Mitocondrias

11. Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra
cargado de vesículas de secreción (NT).

12. Conclusiones
 El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.
 El método proporciona un buen contraste entre estructuras y marcaje.
 La técnica satisface los requerimientos de la investigación.
 Se requiere más información inicial para precisar el protocolo a seguir.
 El estudio implica más técnicas a parte de la ME.

13. Bibliografía
1.
H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat lateral amygdala display
a differential pattern of innervation from distinct glutamatergic afferents, Neuroscience, Volume 203, 17 February 2012,
Pages 59-77, ISSN 0306-4522.
2.
Berryman MA, Rodewald RD. An enhanced method for post-embedding immunocytochemical staining which preserves cell
membranes. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):159-70.