1. Hospital General Regional No. 36
CMN Manuel Ávila Camacho
Delegación No. 22 Puebla
PREVALENCIA DE GENOTIPOS Y DE CO-INFECCIONES DEL VPH EN MUESTRAS
DE CÉRVIX CON LESIÓN INTRAEPITELIAL DE BAJO GRADO EN MUJERES DE
HGR 36 / REGISTRO NACIONAL SIRELCIS: R-2014-2102-48
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
ESPECIALISTA EN GINECOLOGÍA – OBSTETRICIA
PRESENTA:
DR. RODOLFO GONZÁLEZ ANDÉRICA
ASESOR EXPERTO: DRA. CELESTINA GONZÁLEZ FRÍAS
MEDICO GINECÓLOGO – OBSTETRA / SERVICIO DE DISPLASIAS
HOSPITAL GENERAL REGIONAL No. 36 IMSS
ASESOR METODOLÓGICO: DRA. VERONICA VALLEJO RUIZ
INVESTIGADOR TITULAR B / DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR. CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DE
ORIENTE IMSS
TESIS
3. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
La prevalencia y distribución de genotipo de virus papiloma humano (VPH)
proporciona las bases para el diseño de programas de prevención.
Aguilar, Vallejo. 2015
4. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
INTRODUCCIÓN
0 20 40 60 80 100
15 - 19
20 - 24
25 - 44
45 - 49
50- 59
60 - 64
> 65
Porcentaje
Edad
• LIEBG
• Incidencia: 105.97 por 100,000
• LEIAG
• Incidencia: 13 por 100,000
• Puebla lugar número 25 de
incidencia
• Incidencia combinada: 53.68
por 100,000
Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica - Secretaria de Salud, 2008 - 2012
5. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
INTRODUCCIÓN • Prevalencia Global (Coinfección):
• 63.6%
• Grupo LIEBG: 58.2%
• Grupo LIEAG: 60%
• Grupo CaCu: 26.4%
Únicamente en
Coinfección:
• 68*
• 26*
• 40
• 82*
• 83
Infección
Única
• 61
• 70
• 73*
• 89 (CP6108)
• 56*
• 69
• 54
• 52*
• 66*
Aguilar, Vallejo. 2015
7. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
HISTORIA
Siglo
XIX
• Transmisión vectorial de verrugas en humanos
Waelsch
, 1917
• Especificidad del virus por su hospedero
Ullman,
1923
• Inoculó extractos de condilomas en heridas
Shope,
1933
• El primer virus aislado en conejos
Walboo
mers,
1999
• VPH (Factor de Riesgo Importante) para CaCu
Zur
Hausen,
2009
• Verrugas genitales y los tejidos de cáncer de
cérvix, contienen genomas del VPH
González C, González R. 2015
8. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
EPIDEMIOLOGÍA
Dirección General de Epidemiología 2011
• 43,330 casos de LIEBG
• Incidencia de 105.97 casos por
100,000
• LIEAG 10 casos por 100,000
• LIEBG 96 casos por 100,000
VPH
• El virus del papiloma (VP)
• Familia Papillomaviridae
• Infectan específicamente epitelio
escamoso
• Partícula viral
• Cápside de 72 capsómeros
• 60 hexámeros y 12 pentámeros
• Los capsómeros se forman por L1
y L2 (proteínas estructurales)
• Diámetro de 55 nm
• El VPH es estable a ambiente
húmedo por meses
Walter Davies, 2011
9. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
VPH
Genoma
• Una molécula de DNA circular de
doble cadena (8 Kb)
• Se divide en tres regiones:
• Región larga de control (LCR)
• Región de proteínas de expresión
temprana (E1 a E8)
• Región de proteínas de expresión
tardía (L1 y L2)
FACTORES DE RIESGO
Britt K. Erickson & Alvarez, 2013
Actividad
sexual
Uso prolongado TEP
Promiscuidad
Co-infección
Actividad sexual a
temprana edad
Predisposición Genética
Carga
viral
Historial de ITS
Inmunosupresión
Pareja sexual con infección
por VPH AR
Persistencia viral
Variantes virales
10. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
El genoma del VPH utiliza la maquinaria celular del
huésped para poder replicarse
ESTRUCTURA
R. Lectura Abierta (45%)
E1-E2 Activadoras de la
transcripción.
E4 Maduración y
replicación.
E5 Estimula la
proliferación.
E6-E7 Oncoproteínas
transformantes.
Región Tardía (40%)
L1-L2 cápside.
Región Larga Control (15%)
Expresión de E6 y E7
HISTORIAN.
Puig-Tintoré LM, 2014
11. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
FISIOPATOLOGÍA
González C, González R. 2015
PASO 1
Fragmentación Viral
Expresar E6
Mantener viva a la célula
Activar cistina (producto de ARNm cistrónico)
Se rompen los enlaces disulfuro por
oxidación
Sustitución, degradación o bloqueo
de función de P53
Activar LCR
Clatrina sella la célula
VPH
Integrina
Heparán sulfato
12. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
FISIOPATOLOGÍA
González C, González R. 2015
Paso 2
Reproducirse
Expresar E7
Crecer
Unión de E7 a PRB
Unión de E7 a E2F
Transcripción
Inhibir supresor tumoral
Proteger el crecimiento
Paso 3
Protegerse
Activar E5 Inmunidad
Inhibir ATPasa
Inhibir MHC II
13. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
FISIOPATOLOGÍA
González C, González R. 2015
Paso 4
Madurar Activar E1 Replicación
Activar E2 Regulación de la replicación
Paso 5
Empaquetar virus Activar L1-L2
14. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
CLASIFICACIÓN DE VPH
Colposcopía. Principios y Practica. Apgar. 2012
Nuevo virus: Secuencia nucleotídica de L1 difiere > 10% del genotipo más próximo.
Subtipo Viral: Diferencia entre 2 a 10% en estructura nucleotídica
Variante Viral: Diferencia < 2% en estructura.
16. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
VARIANTESINTRATIPOVPH ¿POR QUÉ SON IMPORTANTES?
México
Genotipos con variantes que
difieren en 1 – 5%
Las variantes difieren
biológicamente en su potencial
oncogénico
Calleja-Macias IE, 2004 Berumen J, 2001 / Da Costa MM, 2002 /Giannoudis A, 2001
17. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
ABORDAJE INFECCIÓN VPH
CITOLOGIA
SENSIBILIDAD: 50 – 85%
ESPECIFICIDAD: 98%
FALSOS NEGATIVOS: 20 – 45 %
FALSOS POSITIVOS : 10%
HISTOLOGIA
SENSIBILIDAD : 98%
ESPECIFICIDAD: 58%
ESTÁNDAR DE ORO
TAMIZAJE
Wolfgang, 2012
18. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
ABORDAJE INFECCIÓN VPH
DIAGNÓSTICO
TEST DE VPH
SENSIBILIDAD : 90%
ESPECIFICAD: 20 -40%
COLPOSCOPIA
SENSIBILIDAD : 61 %
ESPECIFICIDAD : 94 %
Wolfgang, 2012
19. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
COMPARATIVO SISTEMA BETHESDA
Tipo de muestra
• Frotis convencional
• Base líquida
• Otros
• Adecuación de la muestra
• Adecuado
• Limitado
• Inadecuado
Bethesda, 2014
20. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
SISTEMA BETHESDA
• Categorización general (opcional)
• Negativo para LIE
• Anormalidad
• Interpretación/Resultados
• Negativo para LIE
• Organismos
• Trichomonas vaginalis
• Candidad spp
• Vaginosis bacteriana Gardnerella
• Actinomyces spp
• Herpes
• Otros hallazgos no neoplásicos
• Cambios celulares reactivos
• Inflamación / DIU
• Radiación
• Estado C. glandulares post HTA
• AtrofiaBethesda, 2014
21. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
SISTEMA BETHESDA
• Anormalidades de células epiteliales
• Atípicas (ASC)
• Significado indeterminado,
ASC-US
• No puede excluirse HSIL,
ASC-H
• LSIL
• HSIL
• Sospechas de invasión
• Carcinoma de células
escamosas
• Células glandulares
• Atípicas (AGC)
• Adenocarcinoma endocervical in
situ, AIS (Figura 12)
• Adenocarcinoma
• Endocervical
• Endometrial
• Extrauterino
• No especificado (NOS)
• Otras neoplasias malignas
• NotasBethesda, 2014
23. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
VACUNACIÓN
Indicaciones:
• Antes de inicio de actividad sexual
Dosis:
• IM 3 Dosis de 0.5ml
Esquema:
• 1er Dosis: Fecha elegida
• 2da Dosis: 1 – 2 meses después
• 3era Dosis: 6 meses después de
1er dosis
• Si se interrumpe continuar
esquema
Edad:
• Niñas y niños de 11 o 12 años
(mayor respuesta inmune)
• Puede iniciarse a los 9 años
• Individuos entre 13 – 26 años
• >26 años: Efectividad Disminuida
24. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
VACUNACIÓN
Seguridad:
• No se recomienda en mujeres
embarazadas
• Uso en enfermedad activa: En
controversia
Almacenamiento:
• Refrigeración a 2 – 8 °C
• Protección contra luz
Efectos secundarios:
• Dolor en sitio de aplicación
• Fiebre
• Cefalea
• Nausea
Eficacia:
• Disminución de Riesgo a cáncer
en 70%
• Disminución de Riesgo a Verruga
en 90%
25. CRITERIOSDETAMIZ
• < 21 años
• No cribado en ningún caso
• Promover la prevención primaria
• 21- 29 años
• Citología cada 3 años
• No utilizar nunca la prueba de
VPH-AR
26. CRITERIOSTAMIZ • 30-65 años
• Co-test cada 5 años (opción
preferida)
• Citología cada 3 años (opción
válida)
• Prueba de VPH (incrementa
detección de Ca)
• 65 años
• Finalizar el tamizaje si tamiz
previo adecuado y negativo
• Tres resultados citológicos
consecutivos negativos
• Antecedente de CIN
• Tamizaje por 20 años
• No Tamiz
• Mujeres sin cuello uterino
• Sin antecedente de LIEAG
27. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
SISTEMA BETHESDA
• Anormalidades de células epiteliales
• Atípicas (ASC)
• Significado indeterminado,
ASC-US
• No puede excluirse HSIL,
ASC-H
• LSIL
• HSIL
• Sospechas de invasión
• Carcinoma de células
escamosas
• Células glandulares
• Atípicas (AGC)
• Adenocarcinoma endocervical in
situ, AIS (Figura 12)
• Adenocarcinoma
• Endocervical
• Endometrial
• Extrauterino
• No especificado (NOS)
• Otras neoplasias malignas
• NotasBethesda, 2014
28. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PRUEBA MOLECULAR
Criterios de Elección
1. Evidencia de sensibilidad de 90% en LIEAG
2. Acreditación FDA o European Medicines Agency
3. Elevada especificidad (reducir pruebas complementarias)
4. Prueba de fácil validación y elevada automatización
5. Toma sea en viales genéricos
6. Identificar tipo específico de VPH
7. Posibilidad de usar la técnica para otras pruebas Torné, Del Pino, 2014
29. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PRUEBA MOLECULAR
Torné, Del Pino, 2014*** VPH-BR precursores de lesiones de bajo grado, pueden causar
cáncer (Guimera N, 2013)
30. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
NO AMPLIFICACIÓN
Hibryd Capture ® 2
• Utiliza una secuencia de ARN
• Solo aplicable a células en suspensión
• Detecta 13 tipos de VPH-AR
• 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59 y 68
• No indica el genotipo especifico
• Zona Gris: Positivo / Negativo ¿?
Ordi J, 2005
Cervista ®
• Utiliza secuencia de ADN
• Técnica automatizada
• Únicamente analiza Citología liquida
• Detecta 14 tipos de VPH-AR
• Mix 1: 51, 56, 66
• Mix 2: 18, 39, 45, 59, 68
• Mix 3: 16, 31, 33, 35, 52, 58
• Resultado positivo o negativo
31. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
AMPLIFICACIÓN
• Amplificación del ADN
• Aplicación de cebadores (primers)
• Complementos de secuencia
ADN
• Obtener un gran número de copias
• Aplicable:
• Células en suspensión
• Células sobre portaobjetos
• Cortes de muestras histológicas
Herraez-Hernandez E, 2013
Cobas® 4800
• Basado en PCR (tiempo real)
• No se puede utilizar en parafina
• Resultado positivo o negativo VPH-AR
• En caso positivo reporta:
• 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56,58, 59, 66, 68
• Carga Viral
32. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
AMPLIFICACIÓN ARN
Aptima®
• Detección de 14 tipos de VPH-AR
• Análisis del ARN mensajero (E6 y E7)
• Citología en medio líquido.
• Más específico Hibryd Capture® 2,
Cervista® y Cobas® 4800
• Aprobado como parthner por la FDA
para (ASCUS)
Lloveras B, 2013
33. OTRASPRUEBAS • Positivos Colposcopía
• Negativos Co-Test Anual
• Uso en ASCUS
Genoma Viral
• Análisis de la metilación de los promotores
de CADM1 y MALCADM1 – MAL
• Sensibilidad – especificidad (90 - 80%)
• Células normales positivas para p16p16
• Positivo:
• Una célula con tinción para p16 (marrón)
• Tinción nuclear para Ki67 (roja)
p16 y Ki67
Overmeer RM, 2011
Carozzi F, 2013
Denton KJ, 2010
Saslow D, 2012
38. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PLANTEAMIENTO
La prevalencia viral varía en base a la población estudiada… Castellsague X, 2012
Co - Infecciones
Genotipos
VPH en
citologías
normales
Genotipos
VPH en
LIEAG
González C, González R. 2015
39. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PLANTEAMIENTO
Preguntas de Investigación:
1. ¿Cuál es la prevalencia local de los genotipos virales de bajo poder oncogénico?
2. ¿Existen co-infecciones asociadas entre virus AR y BR en pacientes con LIEBG?
3. ¿Existe relación entre la prevalencia local con la prevalencia mundial?
González C, González R. 2015
40. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS
• Existe una tendencia de infección por múltiples genotipos de VPH
Vaccarella S, 2011, Carozzi F, 2012
• Parejas determinadas de virus que coexisten simultáneamente en una infección.
Plummer M, 2011
• La vacunación llevó a un incremento en las tasas de infección de otros genotipos virales.
Chaturvedi AK, 2011
• Aproximaciones estadísticas
• Regresión logística
• OR Heterogeneidad en las asociaciones.
Spinillo A, 2009
• Algoritmo automatizado
• No se logró consenso en los patrones de co-infección
Kjaer SK, 2008
González C, González R. 2015
41. HIPÓTESIS
Existen diferencias en las prevalencia de los genotipos virales de bajo
potencial oncogénico de virus papiloma humano con respecto a otras
regiones geográficas, así como un alto porcentaje de co-infecciones en casos
de lesión intraepitelial de bajo grado en pacientes del servicio de Clínica de
Displasias del Hospital General Regional No. 36 / Instituto Mexicano del
Seguro Social en la Ciudad de Puebla, Puebla.
González C, González R. 2015
43. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
OBJETIVOS
General:
• Determinar la prevalencia de genotipos virales y de co-infecciones
Específicos:
• Identificar genotipos virales de VPH con mayor prevalencia por grupo etario
• Comparar los genotipos prevalentes con lo reportado en las publicaciones
• Determinar la prevalencia de co-infecciones por distintos genotipos virales
González C, González R. 2015
45. MATERIALYMÉTODOS
González C, González R. 2015
Tipo de Estudio
• Estudio prospectivo, observacional y descriptivo.
Ubicación Temporal
• Pacientes femeninas con diagnostico citológico, colposcópico e
histopatológico de LIEBG
• Servicio de displasias del Hospital General Regional Número 36
• Periodo Mayo 2014 – Agosto de 2015
• Genotipificación viral se realizó en el laboratorio de Biología Molecular
CIBOR
46. MATERIALYMÉTODOS
González C, González R. 2015
Estrategia de Trabajo
• Pacientes con criterios de inclusión
• Se informó del presente estudio y se invitó (consentimiento informado)
• Llenado de hoja de recolección de datos
• Toma de cepillado cervical
• Finalizando con la entrega de los viales con brocha cervical en el
Laboratorio de Biología Molecular del CIBIOR
48. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
MARCO MUESTRAL
González C, González R. 2015
Universo de Estudio
• Población femenina de entre 25 a 64 años con diagnóstico de LIEBG en
control por servicio de Displasias HGR 36.
Sujetos de Estudio
• Pacientes de sexo femenino
• Derechohabientes de 25 a 64 años de edad con diagnóstico de LIEBG
50. CRITERIOS
González C, González R. 2015
Criterios de Inclusión
• Pacientes femeninas
• Edad de 25 a 64 años
• Diagnóstico citológico, colposcópico e histopatológico de LIEBG
Criterios de Exclusión
• Infección vaginal
• Flujo menstrual presente
• Atrofia genital
• Pacientes embarazadas
• Menores de edad
• Pacientes que no aceptaron participar en el estudio
Criterios de Eliminación
• Muestras mal conservadas (ADN degradado)
• Muestras que durante el procesamiento sufrieron deterioro
52. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
MUESTRA
Tamaño
• Limitado al tiempo y criterios de inclusión en el que se desarrolló el estudio; en
periodo de Mayo de 2014 a Agosto de 2015.
98
54. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
DEFINICIÓN DE VARIABLES
González C, González R. 2015
Variable Definición Conceptual Tipo Escala de Medición
Genotipo
Viral
Homología en la secuencia de nucleótidos del
gen L1 del VPH.
Tipo nuevo: Variación >10% en secuencia de L1
Cualitativa Presencia o ausencia
Co-infección
por VPH
Presencia de dos o más genotipos de virus
papiloma humano en una LIEBG. Cuantitativa
Numérica continua (1-
37 tipos)
56. RECOLECCIÓNDEDATOS
González C, González R. 2015
La recolección datos y de la muestra se
llevó a través de cuestionario validado por
el comité de ética.
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
Coordinación de Investigación en Salud
Comisión Nacional de Investigación Científica
CUESTIONARIO
FICHA DE IDENTIFICACIÓN
Nombre: _________________________________________________________________________________
Afiliación: ________________________________________________________________________________
Edad: ________________ Sexo: F M Peso: ________________ Talla: ________________
Dirección: ______________________________________________________________________________
________________________________________________________________ Teléfono:______________
ANTECEDENTES HEREDOFAMILIARES
Diabetes Sí No __________________________________________________
Hipertensión Sí No __________________________________________________
Cardiopatías Sí No __________________________________________________
Cáncer Sí No __________________________________________________
Otros Sí No __________________________________________________
ANTECEDENTES PERSONALES NO PATOLOGICOS
Escolaridad: Analfabeta Primaria Secundaria Bachillerato Licenciatura
Carrera Técnica Postgrado Completa
Estado civil: Casada Soltera Unión Libre Viuda Divorciada
Estrato socioeconómico: Alto: Medio: Bajo:
Alimentación: Buena: Regular: Mala:
Carnes de Res: _____ Carne de Cerdo: _______ Carne de Pollo: ________ Pescado: ___________
Leche: ____________ Huevo: ______________ Café: ________________ Verduras: ___________
Frutas: ____________ Embutidos: ___________ Enlatados: ___________ Refrescos: __________
ANTECEDENTES PERSONALES PATOLÓGICOS
Diabetes, hipertensión,
cardiopatías, enfermedades
autoinmunes, VIH, hepatitis
B/C, transfusiones, cirugías,
tabaquismo, alcoholi smo,
medicamentos, drogas.
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ANTECEDENTES GINECO-OBSTÉTRICOS
Menarca: Gestas: ____ Partos: ____ Abortos: ____ Cesárea: ____ FUM: ______________
IVSA: _____ PS: ____ Tipo de Relaciones Sexuales: Vaginal: Anal: Oral:
58. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PROCEDIMIENTOS
González C, González R. 2015
Toma De Muestra
1. Paciente en posición de litotomía
2. Colocación de un especulo vaginal
3. Rectificación de eje uterino
4. Raspado cervical con brocha cervical
5. Muestra de endocervix y exocervix dando 3 giros al mismo en sentido horario
6. Se colocó muestra en el vial (PreservCyt)
7. Se almacenó muestra a 4oC hasta la extracción de ADN
59. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PROCEDIMIENTOS
González C, González R. 2015
Extracción de ADN
• Centrifugación de Muestra a 4000 rpm por 20 minutos a 4° C
• El botón celular se resuspendió en 1 ml de PBS
Extracción de ADN (QIAamp DNA Mini Kit)
• Se realizaron 5 procesos de lavado a la muestra que incluyeron, centrifugación,
incubación, y aplicación de sustancias buffer
• El ADN purificado se almacenó a -20°C hasta su uso.
60. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PROCEDIMIENTOS
González C, González R. 2015
Determinación de VPH por PCR
• Se evaluó la calidad de ADN mediante PCR amplificando gen de ciclofilina
• Las muestras positivas Prueba de oligonucleótidos universales
• PGMY09 / 11 y GP5 / GP6 Amplificaron Gen L1 del VPH.
• Las muestras positivas se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1%
• Solo las muestras positivas a VPH se analizaron por Linear Array.
61. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PROCEDIMIENTOS
González C, González R. 2015
Hibridación de Los Productos Amplificados
• Se transfirieron 75 μL del amplicón desnaturalizado a charola
• Charola con 4 ml de una solución de hibridación
• Con una tira de genotipado de VPH
• Tira de nylon con las 37 sondas de ADN (canales)
• Se incubó y centrifugó en 4 ocasiones acorde a especificaciones técnicas
• El amplicón marcado con biotina se hibridó con alguna de las sondas
62. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
PROCEDIMIENTOS
González C, González R. 2015
Detección
• Se lavaron las tiras en 4 ocasiones para eliminar el material no fijado
• Múltiples soluciones
• Se incubaron en cada ciclo de purificación
• Cuando un resultado fue positivo la reacción dio un color azul en la posición
correspondiente a el (los) genotipo (s) presente (s) en la muestra.
64. ANÁLISISDEDATOS
González C, González R. 2015
Se calcularon las frecuencias de infección de los diferentes genotipos
virales. Se calcularon las medias y rangos de los diferentes factores
considerados en el estudio.
• Los datos fueron analizados usando el programa Prisma Graphpad
versión 5.
66. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
RECURSOS HUMANOS RECURSOS MATERIALES
• Investigadores que participaron en
el estudio
• Médicos residentes de
Ginecología – Obstetricia
• Personal de enfermería
• Personal de Laboratorio
• Hojas blancas
• Fotocopiadora
• Lápices / Bolígrafos
• Computadora / Internet
• Colposcopio
• Cepillo para toma de muestra:
Rovers cervix Brush
• Medio de transporte de la muestra
PreservCyt Solution
• Mesa de exploración
• Espejos vaginales
• Guantes estériles
• Mesa / Escritorio / Silla.
González C, González R. 2015
67. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
RECURSOS FINANCIEROS CRONOGRÁMA DE ACTIVIDADES
Investigación sometida a concurso para
financiamiento en la Convocatoria del
Fondo de Investigación en Salud
Gráfica de Grantt
González C, González R. 2015
05 / 06
2014
06 / 07
2014
07 / 09
2014
10 / 12
2014
07 / 09
2015
Elaboración del protocolo
Autorización del protocolo
Recolección de muestra
Detección y tipificación del VPH
Análisis de los resultados
Conclusión del proyecto, publicación y difusión.
69. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
CONSENTIMIENTO INFORMADO
González C, González R. 2015
Investigación con riesgo mínimo
• Se elaboró una carta de consentimiento informado
• Se recabaron firmas de participantes
• Proyecto apegado a Ley General de Salud - Declaración de Helsinki.
• Se eliminaron los nombres de la base de datos
• Población derechohabiente del IMSS
79. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
DISCUSIÓN
González C, González R. 2015
Prevalencia VPH 51.8%
Co – infección 63.6%
LIEBG 58.2%
Infección Simple: 68, 26, 40, 82,
y 83
Co – Infección: 61, 70, 73, 89
(CP6108), 56, 69, 54, 52, y 66
Prevalencia 41.8 %
Co – infección 51.06 %
LIEBG 100%
Infección Simple: 55, 71 y 81
Co – Infección: 6, 11, 16, 31, 33,
39, 42, 52, 53, 54, 58, 59, 61, 62,
66, 84, CP6108
Genotipos Prevalentes: 52, 59,
CP6108, 31 (infección)
Aguilar,Vallejo,2015
GonzálezC,GonzálezA,2015
80. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
CONCLUSIONES
• Se fundamenta línea de investigación en genotipos virales no determinados por Linear Array
• Co – Infección inversamente proporcional a edad de infección
• 20 a 30 años 50% de las pacientes presento un genotipo viral
• 64.7% de las paciente presento infección por un solo genotipo viral
• Asociación de AR-BR en un 33%
González C, González R. 2015
81. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
CONCLUSIONES
González C, González R. 2015
• La correlación entre inicio de vida sexual e infección por VPH molecularmente activa es alta
• IVSA 18 – 22 años
• 1 Genotipo: 28.57%
• Genotipo no determinado: 14.28%
• Con infección: 16.6%
• Probabilidad de infección: 46%
82. 8000/0
4000
30005000
6000 2000
7000 1000
Poli - A (Tempranos)
Poli - A (Tardíos)
VPH
LCR
CONCLUSIONES
González C, González R. 2015
• Vacuna: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58
• Genotipos: 55, 71, 81, 39, 42, 53, 54, 59, 61, 62, 66, 84, CP6108
• Solo existe protección en 30% de los genotipos documentados por FDA para vacuna
nonavalente en nuestra población de estudio
• No evidencia científica significativa para avalar la teoría de protección cruzada
• No protección por vacunación frente a lesiones de bajo grado VPH BR.