2. La microdiálisis es una técnica de muestreo in vivo que
permite la monitorización de los procesos químicos que tienen
lugar en los tejidos (incluido el SN) de un organismo vivo.
La microdiálisis aplicada al SNC (MC) supuso un gran avance en
el estudio funcional del sistema nervioso:
Mediante la MC podemos obtener neurotransmisores, sus
metabolitos o cualquier sustancia endógena del líquido
extracelular de cualquier región o área cerebral, en un animal
consciente y en libre movimiento.
Administrar sustancias exógenas (drogas, fármacos, toxinas ,
etc) localmente (in situ) en cualquier de esas regiones.
Doble función:
Captación de moléculas endógenas:
Administración local de sustancia exógenas
3. Fundamento de la Microdiálisis
La MC consiste en la implantación de una
membrana de diálisis en una región
cerebral, a través de la cual se produce un
intercambio de sustancias entre el líquido
extracelular y el interior de la membrana
que contiene un medio de perfusión (una
disolución iónica isotónica).
Los neurotransmisores y otras moléculas
de interés difundirán hacia el interior de la
membrana (a favor de su gradiente de
concentración), y son recogidos por el
fluido de perfusión para su posterior
análisis (dializado).
La MC mimetiza la función de los capilares en el
tejido cerebral
3
4. Fundamento de la Microdiálisis
El medio de perfusión puede contener una sustancia
exógena cuyo efecto deseamos estudiar, que difundirá
hacia el espacio extracelular.
La membrana de diálisis es permeoselectiva ya que limita
el paso de moléculas en función de la naturaleza química
y peso molecular de la sustancia y del material de
construcción.
Normalmente solo difunden moléculas de relativo bajo
peso molecular (menores de 20-100 KD).
Moléculas de elevado peso molecular como proteínas no
atraviesan la membrana, lo cual evita la interferencia de
éstas con las moléculas de interesen en los dializados o la
degradación enzimáticas de los neurotransmisores .
La técnica fue ideada por Bito et al. (1966) y, aunque
inicialmente presentaba ciertas limitaciones, fue
posteriormente perfeccionada por varios investigadores
(Delgado et al, 1972 y 1984; Ungerstedt y Pycock, 1974;
Ungerstedt 1982, 1989), 4
5. Sonda de microdiálisis
Para implantar la membrana en una región
cerebral, ésta se acopla a un dispositivo metálico
(rígido) que contiene un tubo de entrada (inlet) y
un tubo de salida (outlet), la membrana se situa
entre ambos tubos o se une al extremo distal del
dispositivo, a este conjunto se le denomina sonda
de microdiálisis.
Existen varios tipos de sondas:
Transversales
Verticales:
En forma de U
Concéntricas
5
6. Sondas de microdialisis
La microdiálisis transcerebral consiste en implantar una
sonda en sentido horizontal, haciendo dos orificios en las
regiones temporales el cráneo y pasando la membrana a
través de uno de ellos con ayuda de una fina guía
metálica.
Con este tipo de sondas se puede dializar extensas áreas
cerebrales y puede ser implantada en zonas superficiales
como el cortex, zonas de profundidad media como el
estriado o el hipocampo, pero su implantación en áreas
más profundas presentan más dificultades.
La sonda debe ser construida de forma precisa y aquellas
zonas de la menbranas que queden por fuera del área a
perfundir deben ser recubiertas mediante una resina
epoxi.
Estas limitaciónes así como el delicado y complicado
procedimiento quirúrgico necesario para la colocación de
la membrana, hace que actualmente su uso esté
decayendo. 6
7. Sondas de microdialisis
1 2
Colocación de sondas
transversales en Cortex (1),
Estriado (2) y pineal (3)
3
7
8. Sondas de microdiálisis
entrada
Sonda vertical concéntrica salida
En las sondas concéntricas, el tubo de entrada va por el
interior de tubo de salida, excediendo un poco la longitud de
éste, la membrana de diálisis en forma de saco, recubre el
extremo distal del tubo de entrada y se fija a los bordes del
tubo de salida con resina epoxi. El líquido de perfusión sale del
tubo de entrada a través de un pequeño orificio y fluye hacia
abajo rellenando el espacio que ocupa la membrana y
posteriormente fluye en sentido contrario entre el espacio
existente entre el tubo de entrada y salida.
Sonda vertical en U
Las sondas en U los tubos de entrada y salida
están adyacentes, la membrana se une a la
parte distal de ambos tubos
8
9. Sondas de microdiálisis
Las sondas verticales permiten
dializar áreas pequeñas y a
cualquier profundidad
Colocación de una sonda vertical en el estriado
Las sondas pueden ser de fabricación propia o pueden utilizarse sondas
comerciales perfectamente preparadas y listas para usar. Las
dimensiones y características de las sondas varían dependiendo del
animal de experimentación y del área cerebral objeto de estudio.
En nuestro laboratorio utilizamos la rata como animal de experimentación
y usamos sondas comerciales (concéntricas) de la marca
CMA/Microdialysis (Suecia).
9
10. Sondas de microdiálisis
Modelo CMA12
Longitud de membrana: 1, 2, 3 o 4 mm
Diámetro de membrana: 0.5 mm
Diámetro del eje de acero: 0.64 mm
Longitud del eje: 14 mm
Volumen interno del tubo entrada:
despreciable
Volumen interno del tubo de salida: 3 µL
Material membrana: policarbamato (PC)
poliestireno (PE), otros polímeros (PES, CMA 12
PAES)
Cut-off: 20 o 100 Kd
Otros modelos: CMA11, CMA7, CM10,
CMA20
10
Otras marcas: BAS, ESA
11. Perfusión y obtención de dializados
Para que el medio de perfusión fluya a través de la
sonda, el tubo de entrada se conecta mediante finos
tubos de teflón a una jeringa (que contiene el líquido
de perfusión) y la jeringa se acopla a una bomba de
perfusión en la que se fija un determinado flujo.
Como el dispositivo es un sistema cerrado, el mismo
impulso hace fluir el líquido de perfusión inicialmente
por el tubo de entrada y luego por el tubo de salida.
La recogida del dializado se realiza, conectando la
salida a un estrecho vial de forma cónica.
Para un recolección automática los tubos de recogida
se colocan en un colector de microfracciones, en
donde las muestras de dializado se van acumulando
durante un periodo determinado de tiempo, hasta su
posterior análisis.
11
13. Flujo de perfusión
La perfusión debe realizarse a una tasa de flujo muy
lenta, normalmente no debe superar los 2 µl/min (0,1
–2 µl/min), aunque las sondas están adaptadas para
soportar hasta 10 µl/min.
El flujo es uno de los parámetros que debe ser
controlado de forma adecuada, ya que de él depende
el rendimiento de la sonda
La MC nos permite recoger muestras durante un
periodo de tiempo más o menos prolongado (4-24 h)
y a intervalos variables (15, 20, 30 min), por lo que
el volumen de dializado recogido dependerá del
tiempo y del flujo de perfusión. El flujo puede
ajustarse para obtener un volumen de dializado
suficiente para el análisis, aunque es preferible
ajustar del tiempo de recogida de cada muestra, con
lo cual se ganaría en eficacia.
13
14. Medio de perfusión
Se debe utilizar un medio isotónico con el líquido
intersticial del tejido cerebral y de composición iónica y
pH lo más próximo posible al Líquido Céfaloraquídeo
(LCR).
Normalmente se utilizan disoluciones iónicas
(electrolíticas) que son variaciones del medio Krebs-
Ringer o LCR artificial. La composición iónica mínima del
medio de perfusión debe ser: ClNa, ClK y Cl2Ca, pero
puede ser complementado con Cl2Mg, PO4HNa2 y
glucosa, a pH 7,4.
En nuestros experimentos utilizamos un medio Ringer
con la siguiente composición: ClNa 147 mM, ClK 4 mM y
Cl2Ca 3.4 mM.
La drogas, tóxicos o fármacos que queremos ensayar
pueden disolverse en el líquido de perfusión, aunque si
eso no es posible (solubilidad, elevado peso molecular
para atravesar la sonda, etc) también se pueden 14
administrar por vía sistémica.
15. Medio de perfusión
Un componente del medio de perfusión que puede afectar
de manera importante a la liberación de
neurotransmisores es el ión Ca +2, su concentración en el
líquido de perfusión puede variar desde un valor
fisiológico de 1,2 mM hasta 3,4 mM.
La ausencia de Ca+2 en el medio de perfusión disminuye
la liberación de muchos neurotransmisores y un aumento
en la concentración de Ca+2 implica una mayor liberación
basal de los neurotransmisores, lo cual podría ser
importante en el momento de cuantificar los bajos niveles
de neurotransmisores en un dializado recogido en
condiciones basales.
Para intentar resolver el problema anterior (bajos niveles
de neurotransmisores), en ocasiones se incluyen en el
medio de perfusión inhibidores de la recaptación o
degradación de los neurotransmisores, aunque la
presencia de estos agentes complica la interpretación de
los resultados y además pueden influir en los efectos de
las sustancias que estamos ensayando. 15
16. Medio de perfusión
Algunos medios de perfusión contienen también
glucosa para evitar la depleción de este compuesto
del espacio intersticial producido por una continua
perfusión. Además la glucosa constituye un nutriente
esencial para las neuronas que facilita su recuperación
debido al daño mecánico producido por la
implantación de la sonda.
No obstante, muchos experimentos mostraron que la
presencia de glucosa en el medio de perfusión no
influye en el metabolismo neuronal durante los
experimentos de microdiálisis.
Además este compuesto puede favorecer el
crecimiento bacteriano que pudiera afectar a la
extracción de neurotransmisores.
16
17. Recuperación de la sonda
En una experiencia de microdiálisis no se recoge el
100% de las sustancias presentes en el espacio
extracelular en torno a la sonda, ni las sustancias que
se administran difunden por completo, sino que
dependiendo de varios factores, se recogerá o
difundirá sólo una fracción del total.
Recuperación relativa. Relación entre la concentración
de una sustancia medida en el dializado y su
concentración en el medio exterior a la membrana de
microdiálisis. Se expresa en porcentaje.
Recuperación absoluta. Es la cantidad total del
compuesto que atraviesa la sonda por unidad de
tiempo.
El valor de la recuperación absoluta depende de la
concentración del compuesto en el medio exterior
mientras que la recuperación relativa no
17
18. Recuperación relativa
La recuperación de una sonda para cada una de las
sustancias estudiadas se determina normalmente in
vitro.
Para ello, se introducen la sonda en un medio que
contiene una concentración conocida del compuesto
en cuestión. Después de perfundir la sonda (en unas
determinadas condiciones), se recogen muestras de
dializado y se determinan la concentración de la
sustancias por el método elegido.
La recuperación se expresa como el porcentaje entre
la concentración medida en los dializados y la
concentración presente en el medio externo a la
sonda. Este valor sería la recuperación relativa
18
19. Factores determinantes de la
recuperación
Longitud y diámetro de la membrana. A mayor
superficie mayor recuperación.
El gradiente de concentración de la sustancia entre el
interior de la sonda y el espacio intersticial.
Peso molecular de la sustancia. En general a mayor
peso molecular menor recuperación (relación
exponencial), aunque en este caso hay que tener en
cuenta, la carga de la molécula, su forma, su
coeficiente de difusión y el “cut off” de la membrana.
La temperatura. Un aumento de la temperatura
aumenta el porcentaje de recuperación.
Otros factores. PH, uniones inespecíficas del la
sustancia a membrana u otros elementos de la sonda o
tubos, degradación de las sustancia durante el
recorrido, etc
19
20. Tasa de flujo y recuperación
El flujo de perfusión. El factor
que más influye sobre la
recuperación de una
determinada sonda para una
sustancia en concreto es la
tasa de flujo.
La recuperación relativa
disminuye al aumentar el
flujo, mientras que la
recuperación absoluta,
aumenta al aumentar la tasa
de flujo hasta alcanzar una
meseta a tasas de flujo en las
que se consigue la máxima
difusión.
20
21. Tasa de flujo y recuperación
Aunque la utilización de flujos altos aparentemente
favorecería la captación de mayor cantidad de sustancias por
unidad de tiempo no es conveniente su utilización, ya que se
produciría un efecto de “lavado excesivo” del líquido
extraneuronal induciendo un desequilibrio fisiológico que
afectaría a la dinámica del proceso de liberación de
neurotransmisores.
Además, el empleo de altas tasas de flujo originaría un
excesivo incremento de presión hidrostática y otras fuerzas
que podrían ocasionar daños en la membrana o al tejido
neuronal.
Por lo tanto se emplean tasas de flujo bajas, normalmente
no superiores 2,5 µl/min, aunque el empleo de tasas muy
bajas (< 1 µl/min) implicaría la obtención de volúmenes de
muestra muy pequeños que podría ser insuficiente para la
técnica de cuantificación utilizada, lo cual obligaría aun
tiempo de muestreo muy prolongado
21
22. Implantación de la sonda
La implantación de una
sonda en un área
cerebral se realiza
utilizando un aparato de
estereotaxia, que es un
dispositivo mecánico que
sujeta e inmoviliza
totalmente la cabeza de
un animal anestesiado,
permitiendo alcanzar con
gran precisión cualquier
punto del cerebro.
22
23. Implantación de la sonda
Para la fijación del cráneo del
animal se requiere insertar una
barra metálica en cada conducto Barra metálica
auditivo externo. Una vez
insertadas correctamente, se
sujetan a unos pilares del aparato
de estereotaxia y para conseguir
una absoluta inmovilización de la
cabeza se fijan los incisivos
superiores a un dispositivo Cráneo
horizontal (barra de incisivos).
Una vez inmovilizada la cabeza del cánula
animal, se procede a realizar un
corte longitudinal en la piel del Barra de
incisivos
cráneo, dejando al descubierto la
suturas craneales.
23
24. Implantación de la sonda
Lambda Tomando como referencia el Bregma
(punto de corte entre la sutura
longitudinal y la primera trasversal) o el
Lambda (punto de corte entre la sutura
longitudinal y la segunda trasversal), se
puede localizar cualquier estructura del
encéfalo mediante el cálculo se sus
coordenadas estereotáxicas regis-
Bregma tradas en un atlas estereotáxico. Estos
atlas contienen una serie de imágenes
de cortes trasversales seriados del
encéfalo.
24
25. Implantación de la sonda
En cada sección se
AP muestran diferentes áreas
cerebrales y para cada área
cerebral el atlas
V proporciona medidas
exactas en las tres
direcciones del espacio
respeto a uno de los puntos
de referencia: Antero-
posterior (AP), lateral (L) y
L vertical (V).
Atlas Pellegrino et al: Coordenadas Núcleo estriado respecto al Bregma: :
AP = 2,0 L = 3,0 y V = 6,0.
25
26. Implantación de la sonda
Cánula guía para
sondas CM12
Una vez calculadas las coordenadas del área que
queremos perfundir, el micromanipulador del
estereotáxico se desplaza micrometicamente
hasta la coordenadas L y AP.
En ese punto se practica un pequeño orificio en el
cráneo utilizando un taladro esterotáxico.
Cualquier dispositivo que queramos implantar
(electrodo,, cánula, etc) se fija inicialmente a la
parte inferior del micromanipulador y se introduce
lentamente por el orificio hasta la profundidad de
la coordinada vertical.
Antes de la colocación de una sonda de
mirodiálisis se implanta inicialmente una cánula
metálica o de plástico que consite en un tubo
hueco que servirá de guía y proporciona el
soporte para la colocación de la sonda el día del
experimento.
26
27. Implantación de la sonda
La cánula-guía bebe tener una longitud inferior a la del
eje de la sonda de modo que permita sobresalir la
membrana de diálisis.
Una vez colocada la cánula-guía, se fija al cráneo con
cemento acrílico y para segurar una mejor fijación se
colocan un par de microtornillos alrededor del orificio
antes de colocar el cemento.
27
28. Implantación de la sonda
La administración y toma de
muestras se puede realizar
con el animal anestesiado o
más frecuentemente, con el
animal consciente y en libre
movimiento. En cualquier
caso, los animales se dejan
recuperar de la intervención
quirúrgica durante 24-48
horas y transcurrido este
tiempo, se introduce la
sonda de micordiálisis a
través de la cánula-guía
previamente implantada
28
29. Administración y toma de muestras
El día del experimento, el tubo de
entrada de la sonda se conecta
mediante un fino tubo de teflón a FEP tubing 0,12 mm diametro
la jeringa que contiene el medio
de perfusión colocada en la
bomba de microdiálisis
Seguidamente se acciona la
bomba al flujo elegido (2 µl/min)
se purga el circuito hasta
comprobar que sale líquido a
través de la sonda.
A continuación se introduce la
sonda a través de la cánula-guía
con precaución de no dañar la
membrana.
La salida se conecta a un
microcolector de fracciones.
29
30. Administración y toma de muestras
Después de un período de estabilización de 30-60 minutos, desde
el momento en que se introduce la sonda de microdiálisis, las
muestras se recogen automáticamente a un intervalo de tiempo (15
minutos).
Teniendo en cuenta la velocidad del flujo (2 µl/min) cada muestra
presenta un volumen de 30 μl
Las muestras de dializados se pueden recoger durante varias
horas seguidas (4-24 h).
Las muestras recogidas se analizan inmediatamente en el sistema
de cuantificación seleccionado (HPLC).
30
32. Administración y toma de muestras
Una vez finalizado el experimento de microdiálisis, los
animales son sacrificados por decapitación, se extrae el
cerebro para posteriormente verificar histologicamente la
correcta colocación de la sonda.
32
33. DISEÑO DE UN EXPERIMENTO DE
MICRODIALISIS
Para diseñar un experimento de microdiálisis hay que
tener en cuenta los siguientes aspectos de la técnica:
1. Características moleculares de la sustancia a analizar:
Peso molecular, solubilidad, permeabilidad, presencia en
concentración suficiente en el área de estudio.
2. Características moleculares del compuesto a ensayar.
Solubilidad, permeabilidad en la membrana, tasa de
absorción, metabolización, eliminación, permeabilidad en
la BHE.
3. Las propiedades de la sonda de microdiálisis: Longitud
diámetro, material de la membrana, la recuperación de la
sonda para las diferentes sustancias estudiadas, el tipo de
sonda utilizada y el modo de implantación de la cánula-
guía (vertical o trans-cerebral).
33
34. DISEÑO DE UN EXPERIMENTO DE
MICRODIALISIS
4. El flujo y composición del medio Ringer (puede variar en
función de la concentración de los diferentes iones).
5. El tiempo necesario para obtener unas condiciones
estables y unos niveles adecuados de las sustancias a
analizar.
6. También hay que tener en cuenta la duración del
experimento y constatar el mantenimiento e la
estabilidad de los valores de las sustancias analizadas
durante ese tiempo en condiciones normales.
7. El diseño de experimentos de control.
8. La realización de estudios dosis-respuesta.
34
35. DISEÑO DE UN EXPERIMENTO DE
MICRODIALISIS
9. Como se determinan los efectos en el tiempo no serían
estrictamente necesarios estudios tiempo-respuesta.
10. El desarrollo de técnicas analíticas de cuantificación de
las sustancias estudiadas, suficientemente sensibles para
detectar los a menudo bajos niveles de dichos
compuestos.
Una vez considerado todos estos aspectos se procede a
realizar el diseño de los grupos experimentales y el
protocolo a seguir en cada uno de ellos, según el tipo de
experimentación que queramos realizar.
35
36. Protocolos y diseño de los grupos
experimentales
Efecto del ácido domoico (biotoxina marina) sobre
los niveles estriatales de dopamina:
Duración del experimento 4 horas, intervalo de recogida
15 minutos, flujo 2 µl/min. Aplicación in situ de la toxina,
durante 30 min.
Inicialmente se realiza un grupo control. Para constatar
que en esas condiciones se puede medir DA y que los
niveles extracelulares son estables durante el tiempo de
experimentación. Se perfunde medio Ringer normal
durante todo el tiempo.
Efecto dosis-respuesta. Después del tiempo de
estabilización, se administra medio Ringer normal y se
recogen muestras durante al menos 60 min (4 muestras)
y a continuación se administra la toxina (durante 30 min)
disuelta en el Ringer, se vuelve a cambiar de jeringa y se
administra solo Ringer durante el resto del tiempo (150h)
36
37. Protocolos y diseño de los grupos
experimentales
Ringer Toxina Ringer
60 min 30 min 150 min
Basales Efecto Recuperación basales
A
900
800
DA release (% of basal)
700 Dom 20 µM
600 * Dom 50 µM
500 Dom 100 µM
400 * Dom 500 µM
*
300 *
* * * * *
200 Dom
* *
*
100
0
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 Alfonso et al. 1991
Time (min)
37
38. Protocolos y diseño de los grupos
experimentales
Liberación de DA en medio sin calcio
60 min 60 min 30 min 90 min
Ringer Ringer sin Ca Toxina Ringer
Liberación de DA en medio con TTX
60 min 60 min 30 min 90 min
Ringer Ringer +TTX Toxina+TTX Ringer
Liberación de DA en ratas reserpinizadas.
120 min 30 min
30 min 90 min
Inyección ip Ringer Toxina Ringer
reserpina
38
39. Protocolos y diseño de los grupos
experimentales
Liberación de Da en medio con alto potasio
60 min 30 min 150 min
Ringer 100 mM K Ringer
60 min 30 min 150 min
Ringer 100 mM K + Ringer
Toxina
Liberación de Da en medio con nomifensina
60 min 30 min 150 min
Ringer nomifensina Ringer
60 min 30 min 150 min
Ringer 100 nominfesina Ringer
+ Toxina 39
40. Ventajas de la técnica de
microdiálisis
La microdiálisis cerebral presenta las siguientes ventajas
sobre otras técnicas neuroquímicas in vivo:
Puede realizarse en animales vivos, conscientes y en
libre movimiento.
La MC es un sistema cerrado y debido a la existencia de
la membrana no existe contacto entre el líquido
perfundido y el tejido cerebral, a diferencia de lo que
ocurre en el push-pull,. Ello evita obstrucciones e
infecciones, facilita la implantación y produce un menor
daño tisular en el área estudiada.
El líquido de perfusión sigue un flujo unidireccional, de
modo que se administra por un extremo de la sonda y se
extrae por el otro. Por ello, el sistema sólo requiere una
bomba de perfusión con flujos bajos.
40
41. Ventajas de la técnica de
microdiálisis
La existencia de la membrana de diálisis filtra el medio
extracelular e impide el paso de moléculas proteicas,
como los enzimas que degradan las moléculas objeto de
estudio.
La muestra recolectada es de tal pureza que puede
inyectarse directamente en un cromatógrafo de líquidos,
sin necesidad de preparación de la misma.
Variando la superficie de la membrana (longitud,
diámetro), se puede variar el área perfundida,
adaptándose así a los diferentes tamaños de las regiones
cerebrales estudiadas.
41
42. Ventajas de la técnica de
microdiálisis
Resolución espacial, permitiendo el muestreo de
pequeñas regiones tisulares (p.e. núcleos cerebrales),
Resolución temporal, permitiendo el muestreo de
pequeñas fracciones con una alta frecuencia (min.) y
durante bastantes horas e incluso días .
Permite la realización de estudios a corto (minutos a 24
horas) o largo plazo (estudios crónicos).
Es adaptable para monitorizar muchos de los
compuestos endógenos y exógenos y sus metabolitos
Permite la administración local (intradializado) de
fármacos y drogas a través de la sonda de microdiálisis y
la determinación de sus efectos in situ.
42
43. Ventajas de la técnica de
microdiálisis
Pueden medirse varios compuestos endógenos en la
misma muestra como los neurotrasmisores y sus
metabolitos.
Se pueden medir niveles de compuestos exógenos
(drogas fármacos, toxinas) administradas de forma
sistémica.
Puede existir múltiples sitios de muestreo ya que pueden
implantarse simultaneamente varias sondas en un
mismo individuo.
Puede acoplarse a estudios de las alteraciones
producidas por fármacos en el comportamiento animal
Alta reproducidilidad.
43
44. Desventajas e la microdiálisis
Es una técnica invasiva, no obstante el daño cerebral no
es demasiado grave y el animal se recura en 24-48
horas después de implantación de la cánula.
Se requiere cierto entrenamiento para la inserción de las
sondas.
Es un método caro.
Existen dificultades para estudiar moléculas grandes,
compuestos hidrofóbicos o que presenten elevada
afinidad por las proteínas.
Se requiere una técnica de cuantificación sensible.
Niveles absolutos de neurotransmisores son más difíciles
de evaluar debido al porcentaje recuperación de las
sondas.
44
45. ÓN
CI
TA
N ÓN
SE CI
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LA A NT
DE SU
FIN
POR
S
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