Viernes, 1 de marzo de 2013. Mesa 6: Patología cervical. Nuevas tecnologías en la detección de HPV. Aplicación clínica.

1. Nuevas tecnologías de detección
HPV
Aplicación clínica
Alfonso Alba Menéndez
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES
DE GALICIA

2. HPV
Detectar la presencia Tipar Persistencia Vacunas
¿Qué método uso? ¿Es necesario? ¿Qué es persistencia? ¿Se debe tipar?
EDAD GRUPO DE RIESGO CARGA VIRAL ALTA SENSIBILIDAD
AL DIAGNÓSTICO TIPAJE ESPECÍFICO INTEGRACIÓN TIPO ESPECÍFICO
CONTROL ASC-US VARIANTES
CONTROL POST-TTO
¿ VACUNA?
¿REQUIERO TIPAJE?
¡Valor predictivo negativo!
Ordi J, Alonso I, Torne A, Esteve R, Sierra E, Campo E, Puig-Tintore LM. Human papillomavirus load in Hybrid Capture II assay: does
increasing the cutoff improve the test?
Gynecol Oncol. 2005 Nov;99(2):313-9.

3. Dinámica de la infección VPH
Carga viral
45, 33, 56 16, 33 16
Sensibilidad
Tiempo
VPH 45 VPH 33 VPH 56 VPH 16

4. Dinámica de la infección VPH
Carga viral 45 16 Negativo
Sensibilidad
Tiempo
VPH 45 VPH 33 VPH 56 VPH 16

5. ¿ Cual es la base común de todas las técnicas de detección
molecular ?

8. Complementaridad del ADN
• 5'UTR 575..607 /gene=“E6” ORF 689..>762 /gene=“HPV16" /number=1
BASE COUNT 200 a 207 c 206 g 149 t ORIGIN 1 1 1gatctgcctt
ccttcctgcc cccatgtttg tctttccttg tttgtcttta tatagatcaa 61
gcaggtttta aattcctagt aggagcttac atttactttt ccaaggggga
gggggaataa 121 atatctacac acacacacac acacacacca cactggagtt
cgagacgagg cctaagcaac 181 atgccgaaac cccgtctcta ctaaatacaa
aaaatagctg agcttggtgg cgcacgccta 241 tagtcctagc tactggggag
gctgaggtgg gaggatcgct tgagcccaag aagtcgaggc 301 tgcagtgagc
cgagatcgcg ccgctgcact ccagcctgag cgacagggcg aggctctgtc 361
tcaaaacaaa caaacaaaaa aaaaaaggaa aggaaatata acacagtgaa
atgaaaggat 421 tgagagaaat gaaaaatata cacgccacaa atgtgggagg gcgataacca
ctcgtagaaa

9. Selección de la técnica
Todas las técnicas de detección se basan en la hibridación de secuencias
complementarias de nucleótidos

10. Selección de la técnica
Captura de híbridos
Hibridación reversa
Secuenciación
La sensibilidad y especificidad de todas
las técnicas moleculares depende de
PCR
parámetros de astringencia

11. Ventajas
• Captura de Híbridos: Manejo
• PCR: Sensibilidad
• Secuenciación: “Gold Standard”
• Hibridación inversa: Archivo; infección múltiple

12. Inconvenientes
•Captura de Híbridos: No diferencia tipos
•PCR: Personal experto
•Secuenciación: Costo
•Hibridación inversa: Costo /requiere
PCR previa

13. Los resultados citológicos dependen de la calidad de
la toma y existen variaciones inter e intraobservador
Los resultados moleculares NO dependen de la
calidad de la toma ni del realizador
FALSO
LOS RESULTADOS MOLECULARES DEPENDEN DE
MULTITUD DE FACTORES
Calidad de la toma, tipo de muestra y conservación
Extracción y purificación del ADN
SELECCIÓN DE LA TECNICA
Reactivos
Lectura e interpretación de resultados

14. Calidad de la toma, tipo de muestra y conservación

15. Garantizar criterios de calidad comparables internacionalmente en
la detección y tipaje del ADN del papillomavirus humano, (HPV)

16. Porcentaje de detección de VPH en muestras calibradas
72,87 (95%CI; 43–95)

17. Porcentaje de detección de VPH en muestras calibradas
72,87 (43–95)
Determinaciones estimadas de VPH en 2009
125.000
33900 mujeres deficientemente caracterizadas
cada año en España (Pob.49 millones)

19. CASO A CASO B CASO C
Infección superficial Infección bloqueada Infección intracelular con
transitoria por respuesta inmune alto riesgo
humoral

20. ¿ Cómo suplir las deficiencias de la determinación cualitativa del
ADN viral ?

21. Determinación de VPH
Depende de las características morfológicas y biológicas de la lesión

22. [ADN E6/E7] Potencial transformación
ALTA ?
MEDIA ?
BAJA ?
MEDIA ?

23. E6 / E7
El ARNm nos permitirá determinar la cantidad de proteína oncogénica presente
y, con ello, una estimación real de acerca de la respuesta celular

24. DOGMA GENERAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
DNA
RNA-RNAs
PROTEÍNA
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES

25. DNA E6 DNA E6
Transcripción a mRNA
Traducción a proteína
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES

26. ¿comportamiento de las lesiones?
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES

27. [Prot E6/E7] Potencial transformación
ALTA ELEVADO
MEDIA MODERADO
BAJA BAJO
MEDIA MODERADO

28. Carga viral total
Carga viral total ALTA
ALTA BAJA
BAJA
(respuesta)
(respuesta)
Carga viral relativa
Carga viral relativa ALTA
ALTA BAJA
BAJA ALTA
ALTA BAJA
BAJA
(persistencia)
(persistencia)
Expresión de ARNm
Expresión de ARNm ALTA
ALTA BAJA
BAJA ALTA
ALTA BAJA
BAJA ALTA
ALTA BAJA
BAJA ALTA
ALTA BAJA
BAJA
(proteína)
(proteína)
Riesgo relativo
Riesgo relativo MUY ALTO
MUY ALTO BAJO
BAJO MEDIO
MEDIO BAJO
BAJO ALTO
ALTO MEDIO
MEDIO ALTO MUY BAJO
ALTO MUY BAJO
ARN m
ARN m

29. Espectrometría de masas en tandem
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser desorption/ionization
(MALDI) Time of flight (TOF)

31. Selección de la técnica

32. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) Time of flight (TOF)
HPV % Total % relativo Expresión
45 p16
18
31
16 E2F 16 53% 64%
33
18 16% 21%
31 11% 09%
33 n.d n.d
45 n.d n.d
56 20% 0,6%
E6-E7 HPV16 44 UR
E6-E7 HPV18 12 UR
E6-E7 HPV31 09 UR
MS/MS permite el análisis simultáneo de E6-E7 HPV45 n.d.
hasta 80 analitos por paciente y no es p16 37 UR
dependiente de parámetros externos E2F n.d

33. Sensibilidad MS/MS 91.4% [95% (CI), 84.3%–95.6%]
Sensibilidad RDBH 89.7% [95% (CI), 82.3%–94.3%]
Especifidad y PPV similares

34. Modelo de informe para la determinación múltiple de factores por MS/MS

35. Proposed New Screening Algorithm
Dr. J. Cuzick Women aged 25-64 y
HPV Test
Negative Positive
Normal 5 Year
Cytology
Recall
Normal or
Borderline ≥ Mild
HPV & Cytology Colposcopy
at 6-12 months
HPV Pos & Cyto < Mild
Cyto Neg
HPV Neg HPV Neg & Cyto Borderline Cyto ≥ Mild
Normal 5 Year
Recall Colposcopy
HPV & Cytology at
6-12 months

36. Routine cervical screening with primary HPV testing and cytology triage
protocol in a randomised setting
Kotaniemi-Talonen, L. (Finish Cancer Registry)
BJC, 93, 862 – 867, 2005
CITOLOGÍA
HPV
Negativo Positivo Negativa Positiva
CONTROL CONTROL COLPOSCOPIA
CITOLOGÍA COLPOSCOPIA
Positiva Negativa
COLPOSCOPIA CONTROL

38. Guidelines ASCCP

40. Conclusiones
- Las técnicas moleculares están sujetas a importantes variaciones en sus
resultados
- La utilidad de las pruebas moleculares requiere, necesariamente, de una
evaluación en el entorno clínico
- No solo es importante saber qué tipo de VPH tiene una paciente sino saber
cómo se está relacionando con el huésped
- La disponibilidad de nuevos parámetros moleculares, el estudio de la
dinámica de la infección a lo largo del tiempo o la expresión de proteínas
que interaccionan con el ciclo celular nos permitirá, en un futuro próximo, la
caracterización del riesgo individual de cada paciente
- La tecnología de MS/MS se perfila como la herramienta diagnóstica más
potente y más eficiente para el estudio de patologías de base molecular

41. Gracias por su atención
alfonsoalba@e-icm.net
INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES
Muralla de Lugo, Siglo I D.C.
Patrimonio de la Humanidad