Viernes, 1 de marzo de 2013. Mesa 6: La medicina de reproducción para el ginecólogo general. Utilidad y limitaciones actuales del diagnóstico genético preimplantacional.

1. Utilidad y limitaciones actuales del
diagnóstico genético preimplantacional
Luis González-Viejo Gómez
Director de Laboratorios
Unilabs Reproducción Humana
C/ Velázquez 19, 1º Dcha., Madrid

2. ÍNDICE:
• Definición y marco legal
• Evolución de las técnicas de DGP. (aCGH)
• Indicaciones del DGP. Estado actual.
• Indicaciones del Screening de aneuploidías
Edad materna avanzada
Aborto de repetición
Fallo repetido de implantación
Factor masculino
• Conclusiones.

3. DEFINICIÓN:
• DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL
(DGP): Técnica diagnóstica para el estudio de los
ovocitos y embriones a nivel genético antes de ser
transferidos al útero para su implantación.

4. •MARCO LEGAL DE APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DGP:
1. LEY 14/2006, de 26 mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida
a) Detección de enfermedades hereditarias GRAVES, de APARICIÓN
PRECOZ y NO SUSCEPTIBLES DE TRATAMIENTO CURATIVO.
b) Detección de ALTERACIONES que puedan comprometer la VIABILIDAD
DEL PREEMBRIÓN
*Para cualquier otra finalidad requerirá la AUTORIZACIÓN EXPRESA
individualizada de la autoridad sanitaria competente (Informe
favorable de la Comisión Nacional de Reproducción Humana Asistida).

5. •MARCO LEGAL DE APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DGP:
2. LEY 14/2006, de 26 mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida
Artículo 3.
1. Las técnicas se realizarán solamente cuando haya POSIBILIDADES
RAZONABLES DE ÉXITO, NO SUPONGA RIESGO GRAVE PARA LA
SALUD, física o psíquica de la mujer o la posible descendencia.
Previa aceptación LIBRE y CONSCIENTE por parte de la mujer, que
deberá haber sido informadade sus posibilidades de éxito,
riesgos y condiciones de aplicación de las técncas.

6. •PROBLEMAS GENÉTICOS SUSCEPTIBLES DE ESTUDIO MEDIANTE DGP:
1. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS: screening de aneuploidías
(PGS).
2. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES: Traslocaciones,
inversiones, delecciones.
3. ENFERMEDADES MONOGÉNICAS: Más de 2000 patologías descritas.
4. ESTUDIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD (HLA): Para futuros trasplantes de
células madre hematopoyéticas o trasplante de médula, de un tercero
afecto de enfermedad congénita o adquirida.

7. INDICACIONES PARA LA REALIZACIÓN DEL DGP:
Criterios de inclusión del grupo de interés de la SEF:
•“Cuando el diagnóstico genético sea técnicamente posible, su fiabilidad elevada, las
posibilidades de éxito sean aceptables y las técnicas de reproducción asistida sean factibles.”
* Son INDICACIONES de DGP las enfermedades monogénicas con diagnóstico fiable,
anomalías cromosómicas estructurales o existencia de abortos de repetición.
* PUEDE realizarse DGP en los fallos repetidos de implantación, en pacientes mayores de 35
años, en los factores masculinos severos y pacientes con embarazos previos trisómicos.

8. • EVOLUCIÓN DE LA TÉCNICA DE DGP
1ª publicación de Analisis del FISH de Introducción del
DGP (sexado) 1º CP aneuploidías en láser para AH.
Handyside AH.1990 Verlinsky Y. 1990 embriones D+3 Veiga A. 1997
Munné S. 1995
Ác. Tyrodes + PCR Ác. Tyrodes + FISH CR.16, 18, X e Y Láser + FISH
Diagnóstico de 1º Introducción de
m-CGH para estudio
y 2º CP biopsiados medio sin Calcio ni
de aneuploidías en CPs
Wells D. 2002 Verlinsky Y. 1998 Magnesio
Dulmoulin. 1998
Diagnóstico biopsia CPs Láser + FISH+ Ca/Mg
free
Optimización de la Optimización de la Utilización de a-CGH en
vitrificación como biopsia de Blastos blastómeras, CPs y BTs
Monk M . 1988, Kokkali G. Wells D. 2002; Hellani A 2008,
técnica complementaria 2005, McArthur SJ. 2005 Geraedts J. 2010, Harper. 2010
Zhu. 2011; Chang 2011
Diagnóstico biopsia BTs

9. ARRAYS DE CGH (COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION)
• Técnica citogenética cuantitativa que permite el estudio de las diferentes regiones
de cada uno de los cromosomas.
• Permite la detección de un 42% más de anormalidades
FISH aCGH
Análisis de hasta 12 cr Análisis de todos los cromosomas
Análisis de una sola región del cromosoma Mapeado de todo el cromosoma
Lectura subjetiva por un especialista Lectura objetiva por un software
Material genético de una sola célula Permite amplificación de varias células
Fijación celular Entubado de células
Varias rondas de hibridación Una sola prueba de detección
No requiere amplificación Requiere amplificación (WGA, MDA)
Tasa de error ± 9% Tasa de error ± 1,8%
Detecta alteraciones de la ploidía No detecta alteraciones de la ploidía
Sondas específicas para a. estructurales No detección de balanceadas ni pérdidas de >1MB

10. Theisen A. 2008

11. * Distribución de los tipos de DGPs realizados
27.630 ciclos totales:
61% aneuploidías
17% Monogénicas
16% anomalías cromosómicas estructurales
4% Enfermedad ligada al cr. X
2% Sexado (causas sociales)
* Centros participantes de 16 en 1997 a 57 en 2007
Datos de ESHRE PGD Consortium desde 1997 hasta 2007.
A. Número de ciclos por indicación Harper JC 2011
B. Tanto por ciento por indicación

12. • Indicaciones para Screening de aneuploidías
del consorcio de DGP de la ESHRE:
1. Edad Materna Avanzada (AMA)
2. Abortadora de repetición (RM)
3. Fallo de implantación (RIF)
4. Factor masculino severo (SMF)
5. Gestación anómala previa (PAP)
Datos de ESHRE PGD Consortium desde 1997 hasta 2007. Harper JC 2011

13. 27.630 ciclos totales:
61% Aneuploidías
17% Monogénicas
16% Anomalías cromosómicas estructurales
4% Enfermedad ligada al cr. X
2% Sexado (causas sociales)
Distribución de los ciclos realizados para cromosomopatías estructurales 1997- Distribución de los ciclos realizados de DGP para enfermedades monogénicas
2007. 1997-2007.

14. Datos del registro SEF del año 2010 (70% de la actividad en España):
•De 58.268 ciclos de FIV y/o técnicas afines iniciados, 2719 son ciclos
iniciados para DGP. 4,7% de los ciclos.
% gestación/ciclo % gestación/transfer
Ciclos ovocitos propios 29,2 38,3
CT ovocitos propios 27,9 31,4
Ciclos ovo. donados 50,9 54,9
CT ovo. donados 35,1 37,5
Ciclos con DGP 20,0 39,6
Registro Sociedad Española de Fertilidad 2010.

15. INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:
“Edad Materna Avanzada”

16. EDAD MATERNA AVANZADA (EMA)
•Incremento de aneuploidías en mujeres >35 años
•HUSO MEIÓTICO y/o BAJO NÚMERO DE QUIASMAS.
o Aumento en el riesgo
de embarazos
trisómicos.
o Aumento de posibilidad
de aborto temprano.
o Incremento de fallo de
implantación en TRA.
Munné S & Cohen J. 1998 Spandorfer SD. 2000

17. NO BENEFICIO DEL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS
METODOLOGÍA EMPLEADA A DEBATE:
1.Realización del análisis citogenético: alguna de las
publicaciones tiene tasas de embriones NO
INFORMATIVOS del 20%.
2.No inclusión de CR 15 y 22 directamente implicados
en abortos tempranos. Mastembroek S. 2007
3.Cuestionada la metodología de la biópsia embrionaria
por la alta tasa de abortos. Hardarson T. 2008
4.Optimización de un buen programa de cultivo largo
de embriones. Beyer CE. 2009
5.Los criterios de inclusión son cuestionados, como
edad ≥35 años. Mastembroek S. 2007 y Schoolcraft WB
. 2009
6.No se evalúa la reducción de aborto temprano y la
detección de síndromes.

18. SI BENEFICIO DEL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS
• 183 pacientes 41-44 años.
• 9 CR
• PGS vs. Cultivo Largo
• % Nacido vivo: 32,3% PGS vs 15,5% CL
• 57 pacientes ≥38 años.
• 9 CR
• PGS vs. NO PGS
• % gestación/ciclo: 43% PGS vs 25% CL

19. Respuesta ovárica a la estimulación:
• Beneficio PGS : Pacientes entre 40-45 años y al menos 6 MII.
• Beneficio de criopreservación de ovocitos/embriones en ciclos consecutivos

20. INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:
“Aborto de Repetición”

21. ABORTO DE REPETICIÓN (AR)
•DEFINICIÓN CLÁSICA:
“Existencia de TRES o más pérdidas gestacionales consecutivas de un embrión o feto
de 20 semanas o menos, o con un peso menor a 500 gr. Quedan excluidas Enfermedad
trofoblástica y gestación ectópica” ACOG practice Bulletin. 2002
•El 50% de los abortos recurrentes quedan sin diagnóstico tras el protocolo de estudio.
•El 70% de los casos de AR acaban consiguiendo gestación sin tratamiento.

22. ABORTO DE REPETICIÓN (AR)
•Causas propuestas:
1. Genéticas: Representan sobre el 50-70% de los casos de AR, según la edad de la
mujer. Cramer DW. 2000; Stephenson MD. 2002; Christiansen OB. 2005 El 80% en pacientes por encima de 35
años. Marquard K. 2010. Cuando hablamos de parejas infértiles, la tasa de cariotipos de
restos abortivos alterados alcanza el 65% analizando sólo 5 cr. Lathi RB. 2008
2. Síndrome Antifosfolípido: Responsable de al rededor del 10-15% de los AR. Rai R.2006;
Kutteh WH. 1996
3. Alteraciones Anatómicas Uterinas: Fundamentalmente abortos del segundo
trimestre. ACOG practice Bulletin. 2002
4. Otras trombofilias: Factor V Leiden, mutación G20210A del gen de la protrombina
aumentan entre dos y tres veces las posibilidades de abortos en el primer
trimestre. Otras más discutidas son la Resistencia a la Proteina C Activada (APCR) o
Déficit de proteína C o S y Antitrombina III. Ozcan T. 2002

23. • Otras causas más controvertidas:
5. Causa Endocrina: Diabetes Mellitus, Disfunción Tiroidea, Síndrome de Ovario
Poliquístico, Insuficiencia del cuerpo lúteo.
6. Infecciosas: se ha relacionado con AR infeciones con Ureaplasma, Mycoplasma,
Chlamydia, Estreptococo.
7. Inmunológica: Autoinmune y aloinmune. Aumento de citoquinas de los linf T
colaboradores, NK elevados en cantidad y actividad, compatibilidad paterna (HLA),
actividad de la T reguladoras maternas en la tolerancia al feto…
8. Psicosociales: factores como el estrés, o situaciones emocionales de la paciente
pueden actuar sobre desequilibrios inmunológicos. (Tender loving care)

24. Protocolo de estudio para el AR:
• Pruebas genéticas • Estudio de restos abortivos, biopsia de corion
• Cariotipos paternos
• FISH de espermatozoides
• Test de fragmentación de ADN en semen
• Pruebas anatómicas • Ecografía vaginal 3D
• Histeroscopia diagnóstica
• Estudio de trombofilias • Antifosfolípidos*: AC anticardiolipina IgG, IgM; AC anti-
β2 glicoproteina I IgG, IgM; Anticoagulante lúpico
• Proteina C, S y antitrombina III
• Antimicrosomales, antitiroglobulina
• Mutación G20210A del factor II
• Factor V Leiden
• mutación MTHFR
• Estudio Inmunológico (F. Aloinmunes) • Estudio y valoración por el Inmunólogo especialista**
*Un criterio clínico y otro de laboratorio. Dos determinaciones.
** Cuando estudio de criterios anteriores Normal. Jaslow CR. 2010

25. Aborto Recurrente de causa genética:
•Alteraciones cromosómicas numéricas: 86%
1. Trisomías: 52%
2. Poliploidías: 21%
3. Monosomía X: 13%
•Alteraciones cromosómicas estructurales: 6%
•Otras: 8%
Godjin M. Genetic aspects of miscarriage. 2000
Grupo AR Grupo control ≤37 Grupo control >37
% Emb Aneuploides 70,7 33,3 57,7

26. • Utilización del Screening de aneuploidías en el AR:
1. Pruebas genéticas alteradas (cariotipo, FISH en espermatozoides…)
2. Aborto recurrente idiopático según la edad
34 años y 3 abortos de media la esperanza de nuevo aborto es 38%
40 años y 3 abortos de media la esperanza de nuevo aborto es 70%
ESHRE Capri Workshop Group. 2008; Marquard K. 2010
PGS como opción??

27. • Descenso de las tasas de aborto esperadas en ambos grupos de
edad. Media de embriones transferidos 1,6.
Munné S. 2006
Cribado genético preimplantacional en AR (IVI valencia, 1997-2009)
Edad ≤37 >37 Total
Nº Ciclos 368 260 628
Edad media (DE) 33,6 (2,5) 40,1 (1,8) 36,5 (3,9)
Tasa implantación 40,2 25,1 35,3
Manual práctico de Esterilidad y
Tasa de aborto 13,7 30,0 17,9 Reproducción Humana. 4ª Ed. 2012
Tasa aborto esperada (ESRHE) 38 70 54

28. INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:
“Fallo Repetido de Implantación”

29. FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN (FRI)
•Proceso de baja eficacia en humanos (±30% implantan).
•DEFINICIÓN:
“No consecución de embarazo tras la transferencia de 5-6 embriones de buena
calidad repartidos en al menos 3 transferencias, independientemente de que hayan sido en
fresco o criopreservados”
•CRITERIOS DE EXCLUSIÓN:
1.Mujeres con baja respuesta.
2.Mujeres con patología conocida que comprometa su fertilidad (hidrosalpinx, endometriosis)
3.Mujeres con alteraciones de la cavidad uterina (miomas submucosos, pólipos endometriales, malformaciones
uterinas…)
4.Transferencia de embriones de mala calidad (Tipo C,D)

30. FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN (FRI)
•Protocolo de estudio de FRI:
• Pruebas genéticas • Cariotipos paternos
• FISH de espermatozoides*
• Test de fragmentación de ADN en semen*
• Pruebas anatómicas • Histeroscopia diagnóstica o Histerosonografía
• Estudio de trombofilias • Antifosfolípidos**: AC anticardiolipina IgG, IgM;AC anti-
β2 glicoproteina I IgG, IgM; Anticoagulante lúpico
• Proteina C, S y antitrombina III
• Antimicrosomales, antitiroglobulina
• Mutación G20210A del factor II
• Factor V Leiden
• mutación MTHFR
• Estudio tiroideo • Perfil tiroideo y Ac antitiroideos
• Estudio Inmunológico (F. Aloinmunes) • Estudio y valoración por el Inmunólogo especialista***
* Se realizará si: Factor masculino severo o No factor masculino pero resto de estudio normal.
** Un criterio clínico y otro de laboratorio. Dos determinaciones
*** Cuando el estudio de todos los criterios anteriores normales.

31. FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN (FRI)
•Aplicación del Screening de aneuploidías en FRI:
1.Prueba genética alterada. Indicación PGS.
2.Si estudio NORMAL. No está claro la mejora de tasas de embarazo.
3.Se puede considerar como una opción válida cuando la mujer es >35 años.
4.Fundamental explicar a los pacientes las limitaciones de la técnica en FRI estricto.
5.Otras opciones como Cultivo Largo, Assisted Hatching o Aspiración de fragmentos
tampoco han demostrado una mejora en las tasas de implantación.
6.Medios de cultivo suplementados con GM-CSF (Macrophage colony-stimulating factor)
Salmassi A. 2010; Ziebe. 2012

32. • No observa diferencias
estadísticamente
significativas.
• Posiblemente con una n
mayor.
• Diferencia significativa en
en nº de fallos de
implantación previos.

33. Perspectivas futuras:
•Omicas
•Time-Lapse
•a-CGH en blastocisto

34. INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:
“Factor Masculino Severo”

35. FACTOR MASCULINO SEVERO
•Mayor incidencia de aneuploidías en espermatozoides y embriones en factor masculino
severo. Silber S. 2003; Obasaju I. 1999.
•Es recomendable en oligozoospermias severas la realización de un estudio de FISH en
espermatozoides. Egozcue J. 1997; Vidal F. 2001; Blanco J. 2010
•Las alteraciones meioticas en biopsia de testículo y las aneuploidías en espermatozoides
de eyaculado tienen el mismo valor pronostico clínico. Y justifica igualmente la
realización de screening de aneuploidías. Vidal F. 2008; Velilla E. SEF. 2010

36. FACTOR MASCULINO SEVERO
2010

37. Group 1: Varones 46XY, FISH
con aumento de disomías de
cr sexuales.
Group 2: Varones 46XY, FISH
con aumento en las
diploidías
Group 3: varones 47XYY, con
aumento en diploidías y
disomías de cr sexuales
Muestra correlacción de
anomalías cromosómicas en
espermatozoides y
embriones

38. FACTOR MASCULINO SEVERO
•Microdeleciones del brazo largo del cromosoma Y (Regiones AZF a,b,c) es la causa
genética más frecuente de infertilidad masculina severa.
• Azoospermia no obstructiva: prevalencia 10-15%
• Oligozoospermia severa: prevalencia 5-10%
•Las microdeleciones del cr Y se relaciona con disrupción en la espermatogénesis, y con
un posible aumento en la tasa de aneuploidías en embriones.
• Aumento de tasa de aneuploidías cuando hay
microdelecciones del cr Y. 2010.

39. • Influencia de la edad en el aumento de anomalías cromosómicas

40. CONCLUSIONES

41. 1. Equipo de profesionales con amplia experiencia en DGP. Ginecologos,
Embriólogos y Genetistas.
2. Puesta a punto de un buen programa de cultivo embrionario y de vitrificación de
embriones.
3. Laboratorio con equipamiento adecuado para la realización de las técnicas.
4. Estudio de embriones con tecnología de aCGH.
5. Se realizará si FIABILIDAD ELEVADA, es TÉCNICAMENTE POSIBLE y las
posibilidades de ÉXITO SON ACEPTABLES
6. Sigue siendo necesarios trabajos prospectivos y randomizados rigurosos y
reproducibles.

42. 8. EDAD MATERNA AVANZADA:
• Pacientes de >39 años con al menos 6 ovocitos MII y embriones tipo A, B.
• Vitrificación de ovocitos o embriones de ciclos consecutivos para
posterios PGS.
• Disminución de la tasa de aborto temprano y de descendencia portadora
de síndromes.

43. 9. ABORTO DE REPETICIÓN:
• Es importante contar con un correcto cariotipado de restos abortivos cuando sea
posible o biopsia de corion.
• Hasta un 70% de abortos del primer trimestre son de causa genética.
• Sin causa aparente, valorar edad, si mujer >35 años podemos contemplar el PGS.
• Diferentes estudios avalan el descenso en las tasas de aborto con PGS

44. 10. FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN:
•FIR idiopático: PGS no demuestra mayor eficacia. Otras técnicas de selección
espermática y embrionaria, incluso AH o cultivo largo pueden ofrecer otras
salidas.
•Importancia de la edad de la paciente.
•Nuevas líneas de investigación como las ómicas, inmunología y time-lapse
tienen mucho que aportar a estos pacientes.

45. 11. FACTOR MASCULINO SEVERO:
• Posibilidad de estudio mayor.
• Aumento de tasas de alteraciones cromosómicas con:
a. Oligozoopermias severas
b. FISH y/o estudio de meiosis alterados
c. Delecciones del cr Y en la región AZF.
d. Edad del varón?
• Correlación entre aumento de aneuploidías en espermatozoides y
embriones.

46. ¡¡MUCHAS GRACIAS POR SU
ATENCIÓN!!
Luis González-Viejo Gómez
Director de laboratorios
Unilabs Reproducción Humana
C/ Velázquez nº 19, Madrid