Inmunoglobulinas en Camélidos

1. Inmunoglobulinas en Camélidos
y Tecnología de Nanoanticuerpos
MV MSc Mary Cabrera Núñez

3. Presentación General
• Introducción
• Anticuerpos de Cadena pesada en Camélidos
(HCAbs)
• Nanoanticuerpos (Nb) y Nanotecnología
• Selección y propiedades de los HCAbs
• Conclusiones

4. Introducción
• En 1993, Hamers-Casterman et al. (Nature) la
familia Camelidae, además de los anticuerpos
convencionales, producen anticuerpos funcionales
que carecen de cadenas ligeras, los llamados
anticuerpo de cadena pesada (HCAbs).
• Familia Camelidae: camello (Camelus bactrianus),
dromedario (Camelus dromedarius), llama (Lama
glama), alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama
guanicoe) y la vicuña (Vicugna vicugna), es la
unica familia que permanecen en el suborden
Tylopodia del orden Artiodactyla.
• Los HCAbs no han sido reportados en subordenes
relacionados, como Ruminantia (jirafas, ovinos) o
Suiformes (suinos, hipopotamos) del orden
Artyodactila, al cual pertenecen los Tylopodia.
• Esto demuestra que los HCAbs han evolucionado
hace relativamente poco tiempo atrás (16-18
millones de años)
Árbol filogenético del orden Artiodactyla

5. Sistema inmune adaptativo Camélidos: Los linfocitos B
participan en la respuesta inmune mediante la secreción
de anticuerpos
La placentación epiteliocorial difusa de los camélidos previene
el pasaje de las inmunoglobulinas al feto como sucede en los
demás rumiantes (Weaver et al., 2000).
Los neonatos nacen hipogammaglobulinémicos y toda su
inmunidad perinatal depende de una adecuada absorción del
calostro y las inmunoglobulinas de la leche (De Genst et al.,
2006).
Las principales inmunoglobulinas en el calostro de los camélidos
son las IgG (Weaver et al., 2000), y que sus concentraciones en
el calostro son más altas en los bovinos y caballos (Kamberet al.,
2001). 24 horas post parto la mayor absorción
Nivel sérico de IgG: de o.3 mg/ml al nacimiento a 30.1 mg/ml a
las 24 h post nacimiento.

6. Inmunoglobulinas en Camélidos
• Dos distintos linajes de linfocitos B en camélidos, un linaje sintetizaría los clásicos
anticuerpos de cuatro cadenas y el otro linaje expresaría los anticuerpos carentes de las
cadenas livianas (De Genst et al., 2006).
Isotipos: IgG, IgA, Ig D, IgE, Ig M
• Anticuerpo convencionales: IgG1, IgA, IgD e IgM: No hay evidencia de falta de cadenas
ligeras.
Isotipos IgG en camélidos No convencionales : IgG2 e IgG3
• IgG2 e IgG3 , carecen de las cadenas livianas, conocidas como los anticuerpos de cadena
pesada (HCAbs).
• La pérdida de las cadenas livianas resulta de una alteración de la escisión que impide su
transcripción al ARN mensajero y no de una supresión en el gen correspondiente (Medina
et al., 2004)

7. La IgG, es la clase dominante en suero y la más versátil
• Neutralización (todas)
• Opsonización (IgG1, IgG3)
• Activación de complemento (IgG1, IgG3)
• Citotoxicidad mediada por anticuerpos
(IgG1, IgG3)
• Transferida por la placenta al feto (IgG1,
IgG3)
• Presentan la mayor vida media en plasma
(aprox 3 semanas, 20 veces más que la IgM)
80 % de las Ig del suero: IgG1: 25%, IgG2 y la IgG3: 75% de la IgG sérica
IgG4 1-3%
IgG3 5-8%
IgG2 20-30%
IgG1 60-70%
Abundancia relativa de
IgGs en el suero de
adultos humanos
La respuesta de anticuerpos, ya sea de anticuerpos
convencionales o de anticuerpos de cadena pesada dependen
del inmunógeno.

8. Estructura de una Inmunoglobulina G
convencional

9. Estructura de las Inmunoglobulinas G de los
Camélidos
• (A) Un anticuerpo de cadena pesada (HCAbs) y (B) un dominio variable
simple (VHH) derivado de un HCAbs.
• La falta de cadenas ligeras en los anticuerpos en humanos es causa de
enfermedad. Son incapaces de interactuar con el antígeno.
(A) (B)

10. Isotipos de Inmunoglobulinas G
IgG1, IgG2 e IgG3.
IgG2 y la IgG3 : dominio variable simple (VHH),
una región bisagra y dos dominios constantes (CH2
y CH3) altamente homólogos a los dominios de la
fracción cristalizable de los anticuerpos
convencionales .
HcAbs de camélidos se distinguen sobre la base de
la longitud de sus regiones bisagra y designada
como isotipos de bisagra largo y bisagra corto
Las IgG1: región de bisagra corta, 170 KDa, sus
cadenas livianas tienen un peso entre 28 a 32 KDa y
sus cadenas pesadas pesan entre 50 a 55 KDa.
IgG2 región bisagra grande, 100 KDa y sus cadenas
pesadas pesan 46KDa
las IgG3 región bisagra más corta, 100 KDa y sus
cadenas pesadas pesan 43KDa

11. Distinción de las características estructurales con HCAbs de
tiburón
• Tiburones (Greenberg, 1995) y spotted ratfish (Rast, 1998) ha sido demostrado que
también poseen dos cadenas de polipéptidos idénticas y carecen de cadenas ligeras
• El paratopo (P) de Abs convencionales: formado por los dominios variables de la
cadena pesada y ligera (VH y VL), paratopo de HCAbs: formada solo por el dominio
variable de la cadena pesada ( VHH de camélidos y VNAR en IgNARs de tiburón. Los
dominios VH y VL en Abs convencionales desarrollan interacciones hidrofobias,
mientras que la región correspondiente en hcAbs es hidrofílico (representado en color
rosa).

12. Comparación de
paratopos
Gran parte de la diversidad de los
paratopos en un anticuerpos clásica
se origina en la vinculación VH-VL .
Esa diversificación combinatoria esta,
obviamente ausente en el paratopo
de un VHH ya que no hay dominio VL
en HCAbs. Esta limitación en el
repertorio del paratopo es
compensada por los bucles de unión
con el antigeno que adoptan nuevas
conformaciones, nunca observados en
humanos o en VHs de ratón.
La organización de la secuencia de VH y VHH en marco y los CDR´s .
Se muestran en el marco 2 VHH el sello distintivo de aminoácidos, así como el vínculo interno
disulfuro que se produce en el VHH de dromedario. A continuación se muestra la estructura
plegada de VH (izquierda) y el dominio VHH (a la derecha, con sus cuatro hojas-β- de
transición(detrás) y los cinco hojas β (delante).
Evidentemente, longitudes de bucle (con más aminoácidos: 16 CDR3) aumentan el tamaño
paratopo

13. Nanotecnologia y Nanoanticuerpos
• "La nanotecnología es la manipulación de la materia con al menos una
dimensión del tamaño de entre 1 a 100 nanómetros (escala nanométrica).
La nanotecnología comprende el estudio, diseño, creación, síntesis,
manipulación y aplicación de materiales, aparatos y sistemas funcionales a
través del control de la materia a nanoescala, y la explotación de
fenómenos y propiedades de la materia a nanoescala.
• Cuando se manipula la materia a escala tan minúscula, presenta
fenómenos y propiedades totalmente nuevas. Por lo tanto, los científicos
utilizan la nanotecnología para crear materiales, aparatos y sistemas
novedosos y poco costosos con propiedades únicas.
• Nanoanticuerpos: son excepcionales en el reino animal, dado su reducido
tamaño, que les permitirían acceder a localizaciones celulares y antígenos
inaccesibles para los anticuerpos normales, además de ser posible su
administración oral.
(EE.UU. National Nanotechnology Initiative: www.nano.gov)

14. Nanoanticuerpos (Nb)
Pequeñas regiones proteicas (12-15 kD) derivadas de llamas inmunizadas
Un glóbulo rojo tiene 4,000 nanómetros de diámetro
• Aplicaciones involucran detección de cáncer (albumina), agente
antitrombótico
• No problemas toxicológicos
Dominio Variable
simple (15 kDa)
Monomérico
Partículas alargadas:
Diámetro 2.4 nm
Altura 4nm

15. Esquema del dominio VHH de HCAbs de
camélidos.
a. Las tres regiones determinantes
complementarias (CDRs) del paratopo son
descritos como los bucles de color: CDR1
rojo, verde CDR2 y azul CDR3.
b . Los enlaces disulfuro convencionales que
conecta las regiones marco 1 y 3 (FR1 y FR3)
en los dos - las hojas del dominio de
inmunoglobulina está indicado en amarillo.
Muchos de los anticuerpos de camélidos
contienen un enlace disulfuro adicionales (S-
S) de conexión entre la CDR3 con el final del
CDR1 (camellos) o el principio de la CDR2
(llamas). h bisagra, , G sitio de glicosilación, S
codón de parada de la isoforma secretoria.
El bucle de CDR3 en VHHs de dromedario
(menos en Llama) contiene más bucles
(media de 16 aminoácidos) que en un VH de
humanos o de ratón (promedio del ratón 14
y 12, respectivamente) (Muyldermans et al,
1993)

16. Reconocimiento de sitios antigénicos ocultos
a. El VNAR contacta la enzima sólo con su
CDR1 y las regiones CDR3, este último se
extiende en la grieta y bloquea en la grieta
el centro activo
b. lisozima de pollo en complejo con un VHH
inhibidor de camellos . El CDR3 se extiende
hacia la grieta del sitio activo de la enzima.
c. lisozima de pollo en el complejo con
su sustrato (código PDB 1lsz).
d . lisozima de pollo en el complejo con los
dominios VH y VL de un anticuerpo monoclonal
de ratón convencional (AP Código de 1mlc). La
superficie de interacción Xat con el anticuerpo
convencional se encuentra fuera de la
hendidura del sitio activo de la enzima. PyMOL
program
Asimismo, el bucle de CDR3 en VHHs de
dromedario (menos en Llama) contiene más
bucles (media de 16 aminoácidos) que en un
VH de humanos o de ratón (promedio del ratón
14 y 12, respectivamente) (Muyldermans
Wesolowski, J. 2009

17. Ventajas de los dominios simples de los anticuerpos de
cadenas pesadas (VHHs)de camélidos
Ventaja BaseMolecular
Fácil manipulación genética Dominio simple natural
Alta estabilidad fisicoquímica Eficiente plegamiento
Alta solubilidad Hidrofilicidad incrementada
Reconocimiento de sitios
antigénicos
Tamaño pequeño y CDR3
flexible extendido
Rápida penetración tisular Tamaño pequeño
Facilidad y la velocidad de
descubrimiento de fármacos
Codificadas por genes
individuales y eficientemente
producidos bacterias y
levaduras.
Estabilidad gastro-intestinal Estabilidad y resistencia a pH
extremos
Fuente: Harmsen y De Haard,
2007

18. Facilidad de fabricación y formulación
Técnicas de ingeniería genética permiten una clonación rápida
y selección de antígenos específicos VHH, denominados Nbs.
Ghahroudi et al., FEBS Letters, 1997

19. Propiedades de los nanoanticuerpos
Versus scFV y Fab
Muyldermans, J. Biotechnol, 2001

20. Aplicaciones de los Nb
• Los VHHs poseen algunas ventajas que son aplicadas en
biotecnología
• Estos VHHs son aplicados en la oncología, enfermedades
infecciosas y neurodegenerativas
• Los VHHs son especialmente suministrados por inmunoterapia
vía oral debido a sus resistencia frente a rangos extremos de pH
y la capacidad de unirse al objetivo en altas concentraciones de
agentes caotrópicos (Harmsen y De Haard, 2007).

22. Conclusiones
• Nano anticuerpos superan a clásicos Ab
• Desde su descubrimiento en 1993, el campo de investigación de las
IgG de cadenas pesadas de los camélidos ha crecido rápidamente,
especialmente en la utilización de sus dominios variables simples
(VHHs).
• Estos VHHs, más conocidos como los nanoanticuerpos (Nbs), tienen
muchas propiedades fisicoquímicas que les permiten tener diversas
aplicaciones biotecnológicas.
• Estos Nbs son útiles para diagnosticar infecciones y para tratar
enfermedades como el cáncer, tripanosomosis, enfermedades
neurodegenerativas, entre otras.
• Sin embargo, más investigaciones sobre estos Nbs son necesarias
para encontrar nuevas y mejores aplicaciones para beneficio del
hombre.